Experiência de Meselson e Stahl

O teste da hipótese da replicação semiconservativa

Matthew Meselson e Franklin Stahl, em 1958 realizaram experiências, que tinham como objectivo comprovar a hipótese semiconservativa, trabalhando com a marcação do ADN por incorporação de Azoto pesado 15N.
Os cientistas imaginaram que, se as duas cadeias polinucleotídicas de uma molécula de ADN fossem marcadas, seria possível fazer uma previsão sobre o destino dessas cadeias no decorrer das gerações seguintes.
Segundo a previsão:

a) Após uma replicação, ambas as moléculas filhas estariam marcadas e cada uma delas conteria metade da marcação da molécula mãe original.
b) Após duas replicações, metade das moléculas estaria marcada e, a outra metade não. A metade marcada, conteria a mesma marcação que as moléculas originais (que foram geradas na primeira replicação).

O teste da hipótese semiconservativa foi possível porque na época os autores dispunham de métodos eficientes para marcar as moléculas de ADN assim como para separar as moléculas marcadas das não-marcadas, e entre as marcadas, distinguir as moléculas com diferentes quantidades de marcação.

1ª EXPERIÊNCIA

Na primeira experiência cultivaram bactérias Escherichia coli, num meio de cultura contendo um isótopo pesado de azoto (15N) e outras destas bactérias num meio de cultura contendo azoto normal (14N). Quando as bactérias Escherichia coli vivem num meio de cultura normal (com 14N), o seu DNA, depois de extraído e centrifugado, deposita-se mais próximo da superfície do que do fundo do tubo de ensaio, ao contrário das bactérias que vivem num meio com 15N, que depois de extraído e centrifugado o seu ADN deposita-se no fundo do tubo de ensaio.Isto comprava que as bactérias contendo azoto pesado (15N) são mais densas que as bactérias que contêm o isótopo de azoto normal.

2ª EXPERIÊNCIA

Na segunda experiência, cultivaram-se bactérias num meio com 15N.

Após 14 gerações nesse meio de cultura, pôde prever-se que todo o ADN das bactérias continha o isótopo pesado 15N. Posteriormente as bactérias foram transferidas para um meio de cultura contendo apenas a forma leve do azoto, o 14N.

Depois da transferência para o novo meio, retirou-se imediatamente uma amostra onde se extraiu o ADN, que foi posteriormente centrifugado.Verificou-se que as bactérias da geração parental continham apenas ADN com o azoto pesado. As gerações seguintes porém, já seriam sintetizadas com base no azoto normal.
Deixaram-se assim, as bactérias da geração 0 - G0 dividirem-se nesse meio e o processo foi interrompido:

a) Ao fim de 20 minutos (corresponde ao tempo necessário para a divisão das bactérias de modo a obter uma nova geração) obteve-se a 1ª geração - G1 em que todas as bactérias apresentavam um ADN de densidade intermédia -14N15N (50% de 15N e 50% de 14N).
b) Ao fim de 40 minutos (2ª geração - G2) - 50% das bactérias G2 apresentavam um ADN de densidade intermédia (14N15N) e os outros 50% apresentavam um ADN de densidade normal 14N, conforme podemos ver no esquema mostrado na figura seguinte.

Tipos de azoto:
vermelho = 14N
azul = 15N

Mas, de que maneira foi possível identificar os diferentes tipos de moléculas (contendo diferentes quantidade de 14N e 15N) para verificar se a previsão se confirmava?

A distinção entre os diferentes tipos de ADN foi possível graças a técnica analítica desenvolvida por Jerome Vinograd, que ficou conhecida como centrifugação de equilíbrio em gradiente de densidade.
O gradiente de densidade forma-se quando uma solução de cloreto de césio é submetida a uma ultracentrifugação. O sal de césio distribuísse em concentrações gradativamente maiores, do cimo para o fundo do tubo de ensaio, de modo que a solução é mais densa no fundo e menos densa no topo. Quando moléculas são misturadas com uma solução de cloreto de césio, e essa mistura é submetida a uma ultracentrifugação, as moléculas posicionam-se no gradiente de densidade do césio, numa faixa correspondente à sua própria densidade. Moléculas de ADN com diferentes proporções de 14N e 15N têm densidades diferentes e, portanto, posicionam-se em regiões diferentes no tubo de ensaio.


O 15N é mais denso que o 14N, portanto s as moléculas de ADN distribuíram-se da seguinte maneira no tubo:
100% 15N: mais abaixo (vermelho).
100% 14N: mais acima (azul).
50% 15N, 50% de 14N: posição intermediária (azul/vermelho).

Com a experiência de Meselson e Stahl foi possível verificar que:
1 – As moléculas de ADN extraídas de bactérias cultivadas em meio normal com 14N têm baixa densidade.

2 - O ADN extraído de bactérias cultivadas por 14 gerações em 15N, incorporam esse azoto nos seus nucleótidos, formando um ADN com maior densidade, que se deposita mais próximo do fundo do tubo, depois de centrifugado.

3 - O ADN extraído da primeira geração produzida a partir de bactérias marcadas com 15N e cultivadas em 14N, ficavam numa posição intermediária do gradiente, entre as duas anteriores.

4 –O ADN extraído da segunda geração produzida a partir de bactérias marcadas com 15N e cultivadas em 14N, formavam duas faixas, uma correspondente as moléculas não marcadas (14N) e outra correspondente às moléculas contendo 50% 14N e 50% 15N.

5- O ADN extraído da terceira geração tem-se 75% das moléculas não marcadas e 25% das moléculas marcadas (50% 15N, 50% 14N).

Os resultados experimentais concordaram inequivocamente, com a previsão da hipótese da replicação semiconservativa do ADN, a qual foi então aceita como verdadeira e que é hoje actualmente aceite.

O VIDEO: http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120076/bio22.swf (em inglês)